氟非尼酮对肾纤维化氧化应激反应的作用及机制研究

【摘要】第一章氟非尼酮对UUO大鼠肾间质纤维化及脂质过氧化损伤的影响目的：观察氟非尼酮(AKF-PD)对UUO大鼠肾纤维化的疗效及肾脏组织脂质过氧化损伤的影响,探讨AKF-PD抗肾纤维化的作用机制。方法：建立单侧输尿管结扎(UUO)肾间质纤维化模型。SD雄性大鼠(28只)随机分为假手术组、UUO模型组、AKF-PD治疗组及氯沙坦治疗组,每组7只,于UUO术后14天留取各组大鼠梗阻侧肾脏标本：分别行HE、MASSON及Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组织化学染色,Westernblot检测纤维连接蛋白(FN)以观察大鼠肾纤维化成模情况及药物疗效；提取肾组织匀浆总蛋白以ELISA方法检测脂质过氧化产物8异前列腺素(8-iso-PGF2a),TRASB方法检测丙二醛(MDA)的表达水平。结果：(1)HE和MASSON染色结果显示UUO术后14天模型组大鼠肾组织可见明显间质纤维化病理改变,肾间质损伤指数和肾间质胶原相对面积评分较假手术组明显上升,造模成功；与模型组比较,AKF-PD治疗组及氯沙坦治疗组肾组织间质纤维化程度减轻,肾间质损伤指数和肾间质胶原相对面积评分显著下降(P＜0.05);AKF-PD组抑制UUO大鼠肾间质损伤及Ⅲ型胶原的表达,较氯沙坦组更为显著(P<0.05)。(2)UUO术后14天模型组肾组织中MDA及8-iso-PG2Fa产生明显升高(P＜0.05),AKF-PD能有效减少UUO术后14天病变肾脏脂质过氧化产物8-iso-PG2Fa、MDA的表达(P<0.05)；氯沙坦能有效抑制UUO术后14天病变肾脏脂质过氧化产物8-iso-PG2Fa的表达(P<0.05),对MDA的表达无明显影响(P>0.05)。结论：(1)AKF-PD有抗肾间质纤维化的作用,其疗效优于氯沙坦。(2)AKF-PD能下调病变肾脏组织8-iso-PG2Fa及MDA的表达,AKF-PD抗肾脏脂质过氧化损伤可能是其抗肾间质纤维化作用的重要机制之一。第二章氟非尼酮对UUO大鼠肾脏NADPH氧化酶及磷酸化Akt的影响目的：观察AKF-PD对UUO大鼠梗阻侧肾组织中NADPH氧化酶及磷酸化Akt表达的影响。方法：建立UUO模型。SD雄性大鼠(28只)随机分为假手术组、UUO模型组、AKF-PD治疗组及氯沙坦治疗组,每组7只。于UUO术后14天留取各组大鼠梗阻侧肾脏标本,提取总蛋白以Westernblot检测NADPH氧化酶Nox1、Nox2及磷酸化Akt蛋白表达水平；提取组织匀浆总蛋白以细胞色素C法检测NADPH氧化酶的活性。结果：(1)UUO术后14天模型组肾组织中NADPH氧化酶及亚单位:Nox1、Nox2产生较假手术组明显升高(P<0.01)；与模型组比较,AKF-PD及氯沙坦均能有效减少UUO术后14天病变肾脏]NALDPH氧化酶活性及Nox2的表达(P<0.05);AKF-PD及氯沙坦对UUO术后14天病变肾脏Noxl的表达无明显抑制作用(P>0.05)；两种药物对UUO大鼠肾组织中NADPH氧化酶的作用效果相似。(2)UUO术后14天模型组肾组织中磷酸化Akt表达水平较假手术组明显升高(P<0.05)；与模型组比较,AKF-PD及氯沙坦均能有效抑制UUO术后14天病变肾脏磷酸化Akt的表达(P<0.05)。结论：(1)AKF-PD能抑制UUO大鼠病变肾脏组织中NADPH氧化酶的表达,有效减轻病变肾脏的氧化应激损伤。(2)AKF-PD能下调病变肾脏组织中磷酸化Akt的表达,提示AKF-PD抗氧化应激的作用可能与PI3K/Akt信号通路有关。第三章AKF-PD对AngⅡ诱导NRK-52E细胞内氧化应激反应及磷酸化Akt、ERK的影响目的：观察AKF-PD对AngⅡ诱导大鼠肾小管上皮(NRK-52E)细胞内氧化应激反应及磷酸化Akt、ERK的影响,进一步探讨AKF-PD抗氧化应激反应的作用机制。方法：以大鼠肾小管上皮细胞株(NRK-52E)为研究对象,实验分为正常对照组、AKF-PD组、Losartan组及NADPH氧化酶抑制剂DPI组。分别给予AKF-PD、氯沙坦和NADPH氧化酶抑制剂DPI预处理后再加入血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激60min,运用DCFH-DA作为荧光探针,采用荧光酶标仪检测细胞内活性氧(ROS)的水平；采用Westernblot方法检测NADPH氧化酶亚单位Nox1、Nox2及Collagen1al蛋白质的表达。应用AKF-PD、氯沙坦、PI3K抑制剂LY29004及MEK抑制剂U0126预处理NRK-52E细胞后加入AngⅡ刺激15min收集细胞总蛋白,采用Westernblot方法检测细胞中磷酸化ERK及Akt的表达。结果：(1)AngⅡ刺激肾小管上皮细胞60mmin后ROS产生较对照组显著增高(P<0.01)；与模型组(AngⅡ)比较,AKF-PD、氯沙坦及NADPH氧化酶抑制剂DPI组均能抑制ROS的产生(P<0.05)。(2)AngⅡ刺激肾小管上皮细胞24小时后NADPI氧化酶Nox1、Nox2及Collagen1a1蛋白质表达较对照组显著增高(P＜0.01);AKF-PD、氯沙坦及NADPH氧化酶抑制剂DPI均能降低NADPH氧化酶Nox2蛋白及Collagen1a1的表达(P<0.05),但对Nox1蛋白的表达无明显抑制作用(P>0.05)。(3)AngⅡ刺激激肾小管上皮细胞15min后磷酸化ERK)及Akt水平较对照组明显上升(P<0.05)；与模型组(AngⅡ)比较,AKF-PD、氯沙坦及LY29004、U0126组均能抑制磷酸化Akt及ERK的表达(P<0.01)。结论：(1)AKF-PD能抑制AngⅡ诱导肾小管上皮细胞内ROS及NADPH氧化酶的产生,有效减轻肾小管上皮细胞的氧化应激反应。(2)AKF-PD能下调AngⅡ诱导肾小管上皮细胞磷酸化Akt及ERK的表达,其在抗肾纤维化及氧化应激反应时,能减少PI3K/Akt及MEK/ERK信号通路的传导。第四章AKF-PD对氧化应激反应中PI3K/Akt及MEK/ERK信号通路的影响目的：观察AKF-PD对MEK1Q56P及PI3KP110α-CAAX高表达的NRK-52E细胞纤维化及氧化应激反应的影响,深入探讨AKF-PD抗肾纤维化氧化应激反应的作用机制。方法：(1)质粒转染构建PI3KP110α-CAAX过表达细胞株。实验分为pbabe组(转染空质粒组)、PI3K组(转染P11Oα-CAAX质粒),PI3K+AKF-PD组(转染P110α-CAAX质粒+AKF-PD8×10-3mol/L);分别用流式细胞仪检测NRK-52E细胞内ROS的水平；提取细胞总蛋白,采用Westernblot检测NRK-52E细胞NADPH氧化酶、Collal及磷酸化Akt蛋白表达水平。(2)质粒转染构建MEK1Q56P过表达细胞株。,实验分为pbabe组(转染空质粒组)、MEK组(转染MEK1Q56P质粒),MEK+AKF-PD组(转染MEK1Q56P质粒+AKF-PD8×10-3mol/L);分别用流式细胞仪检钡NREK-52E细胞内ROS的水平；提取细胞总蛋白,采用Westernblot检测NRK-52E细胞NADPH氧化酶、Collal及磷酸化ERK蛋白表达水平。结果：(1)NRK-52E细胞高表达PI3KP110α-CAAX后,细胞内ROS、Collal、NADPH氧化酶p47phox及Nox2表达较对照组显著增高(P＜0.05),AKF-PD干预组能减少ROS、Collal、p47phox的表达(p<0.05),但对Nox2无抑制作用(p>0.05)。(2)NRK-52E细胞高表MEK1Q56P后,细胞内ROS、Collal及NADPH氧化酶Nox2蛋白的表达与对照组比较均明显升高(p<0.05),AKF-PD干预组能抑制ROS、Nox2及Collal的表达(P<0.05)。结论：(1)AKF-PD通过PI3K/Akt信号通路减少磷酸化Akt及NADPH氧化酶p47phox的表达,从而减少ROS及Collal的产生。(2)AKF-PD通过MEK/ERK信号通路减少磷酸化ERK及NADPH氧化酶Nox2的表达,从而减少了ROS及Collal的产生。(3)AKF-PD通过抑制PI3K/Akt及MEK/ERK信号通路减轻了肾脏氧化应激反应,从而减少了肾脏纤维化的形成。
【作者】覃娇；
【导师】陶立坚；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2013，博士
【关键词】氧化应激反应；肾纤维化；氯沙坦钾；模型组；NADPH；肾小管上皮细胞；肾脏结构；信号通路；脂质过氧化产物；细胞调亡；

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